โพรโทพลาสต์ของพืช

ภัณฑิลา อุดร นักวิชาการสาขาชีววิทยา

          การศึกษาวิจัยทางด้านโพรโทพลาสต์ของพืชนับว่ามีประโยชน์มากทั้งในเรื่องของการศึกษาเรื่องกลไกการนำสิ่งต่าง ๆ เข้าสู่เซลล์ กระบวนการสร้างผนังเซลล์และการพอกของสารต่าง ๆ เช่น เซลลูโลส เฮมิเซลลูโลส และเพกทิน นอกจากนี้ยังมีประโยชน์มากในเรื่องการปรับปรุงพันธุ์พืชให้ได้ลูกผสมทั้งข้ามชนิดและข้ามสกุลที่มีคุณสมบัติตามที่ต้องการ เช่น พืชที่มีดอกสีสันสวยงามและทนโรค เป็นต้น เนื่องจากการปรับปรุงพันธุ์พืชด้วยวิธีการแบบดั้งเดิม (conventional breeding) ที่ได้จากการผสมพันธุ์พืชตามธรรมชาติหรือจากการผสมโดยมนุษย์ (อาศัย               เซลล์สืบพันธุ์) ซึ่งเป็นวิธีการที่ใช้ธรรมชาติและปลอดสารเคมีนั้น ยังมีข้อจำกัดบางประการ เช่น ใช้เวลายาวนานและผลที่ได้ยังไม่แน่นอน ชนิดพืชที่จะนำมาใช้ต้องเป็นพืชที่สามารถผสมเกสรระหว่างต้นพ่อและต้นแม่ได้เท่านั้น เป็นต้น ด้วยเหตุนี้การใช้โพรโทพลาสต์ในการปรับปรุงพันธุ์พืชจึงเป็นการแก้ไขข้อจำกัดดังกล่าวได้ และเป็นอีกทางเลือกหนึ่งที่น่าสนใจ หากทำได้สำเร็จก็จะสามารถสร้างพืชชนิดใหม่ขึ้นมาได้ โดยไม่มีข้อจำกัดในเรื่องความแตกต่างของชนิดและสกุลของพืช และยังสามารถนำโพรโทพลาสต์มาประยุกต์ใช้ในเรื่องของการถ่ายยีนเข้าสู่พืช เพราะการถ่ายยีนเข้าไปในโพรโทพลาสต์สะดวกและง่ายกว่าการถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์พืชที่มีผนังเซลล์ที่แข็งแรงล้อมรอบอยู่

 

           ก่อนอื่นมาทำความรู้จักกับโพรโทพลาสต์ของพืช (plant protoplast) กันก่อน โพรโทพลาสต์ของพืช คือ เซลล์พืชที่ไม่มีผนังเซลล์ (naked plant cell) แต่มีเพียงส่วนเยื่อหุ้มเซลล์ (cell membrane) ล้อมรอบองค์ประกอบภายในเซลล์เอาไว้ ซึ่งโพรโทพลาสต์นี้ได้มาจากการย่อยเอาผนังเซลล์ของพืชออกซึ่งจะกล่าวต่อไปในหัวข้อการแยกโพรโทพลาสต์ของพืช จากนั้นเมื่อนำ      โพรโทพลาสต์ไปเพาะเลี้ยงในสภาพที่เหมาะสม ก็จะสามารถสร้างผนังเซลล์ขึ้นใหม่และเกิดการแบ่งเซลล์ต่อจนสามารถพัฒนาไปเป็นต้นพืชที่สมบูรณ์ได้ ด้วยลักษณะพิเศษดังกล่าวนี้จึงมีการนำโพรโทพลาสต์ไปใช้ประโยชน์ในด้านต่าง ๆ ดังที่กล่าวไปข้างต้น

 

การแยกโพรโทพลาสต์ (protoplast isolation) ของพืช

         วิธีการแยกโพรโทพลาสต์แบ่งออกเป็น 2 วิธี

         1. การแยกโดยวิธีกล (Mechanical isolation) ทำได้โดยทำให้เซลล์พืชเกิดการสูญเสียน้ำออกจากเซลล์เพื่อให้เยื่อหุ้มเซลล์แยกออกจากผนังเซลล์หรือที่เรียกว่า ทำให้เกิดพลาสโมไลซิส (plasmolysis) ก่อน จากนั้นจึงตัดชิ้นส่วนพืชด้วยของมีคม จะทำให้โพรโทพลาสต์หลุดออกมาตามรอยตัด สามารถกดเบา ๆ หรือลดความดันออสโมซิส (osmotic pressure) ของสารละลายที่ล้อมรอบชิ้นส่วนพืชเพื่อให้โพรโทพลาสต์หลุดออกมาได้เร็วยิ่งขึ้น แต่วิธีการนี้มีข้อจำกัดหลายอย่าง เช่น ได้ปริมาณโพรโทพลาสต์น้อย เหมาะกับเซลล์ขนาดใหญ่ และอาจทำให้เกิดความเสียหายกับออร์แกเนลล์และส่วนประกอบต่าง ๆ ภายในเซลล์บริเวณที่คมมีดผ่าน

         2. การแยกโดยใช้เอนไซม์ (Enzymatic isolation) มีวิธีการพื้นฐานดังนี้ เริ่มด้วยการทำให้ชิ้นส่วนของพืชปลอดเชื้อโดยการฟอกฆ่าเชื้อ แล้วดึงเอพิเดอร์มิสชั้นล่างออกในกรณีที่เป็นใบหรือตัดชิ้นส่วนพืชเป็นชิ้นเล็ก ๆ เพื่อให้เอนไซม์แทรกซึมเข้าไปได้ จากนั้นใช้เอนไซม์ย่อยผนังเซลล์ซึ่งในพืชแต่ละชนิดจะใช้ความเข้มข้นของเอนไซม์ และเวลาในการย่อยที่แตกต่างกัน เมื่อผนังเซลล์ถูกย่อยหมดแล้วรูปร่างของเซลล์จะเปลี่ยนไปจากรูปร่างเดิมกลายเป็นทรงกลมที่มีเยื่อหุ้มเซลล์ล้อมรอบไซโทพลาซึมอยู่ จากนั้นนำโพรโทพลาสต์ไปแยกเอาส่วนของเอนไซม์และเศษเซลล์ต่าง ๆ ออกเพื่อให้ได้โพรโทพลาสต์ที่สะอาด

         สำหรับในขั้นตอนการใช้เอนไซม์ย่อยผนังเซลล์นั้น เนื่องจากผนังเซลล์ประกอบด้วย เซลลูโลส เฮมิเซลลูโลส และชั้นระหว่างเซลล์ที่อยู่ตรงกลางระหว่างเซลล์พืช คือ มิดเดิลลาเมลลา (middle lamella) นั้นมีเพกทินเป็นองค์ประกอบ จึงอาจต้องใช้เอนไซม์หลายชนิดมาร่วมกันย่อยผนังเซลล์ ซึ่งเอนไซม์ที่ใช้ย่อยผนังเซลล์นี้เรียกว่า ไฮโดรไลติกเอนไซม์ (hydrolytic enzyme) เช่น เซลลูเลส เฮมิเซลลูเลส และเพกทิเนส ทั้งนี้การเลือกใช้เอนไซม์นั้นขึ้นอยู่กับอายุและชนิดของเนื้อเยื่อที่นำมาใช้แยกโพรโทพลาสต์ ส่วนใหญ่จะนิยมใช้ส่วนของพืชที่มีการเจริญเติบโตขั้นที่หนึ่ง เนื่องจากชิ้นส่วนพืชที่มีการเจริญเติบโตขั้นที่สองเซลล์มักจะมีผนังเซลล์ทุติยภูมิที่ประกอบด้วยสารลิกนิน ซูเบอริน และคิวทินซึ่งย่อยได้ยาก นอกจากนี้เซลล์ของชิ้นส่วนที่มีการเจริญเติบโตขั้นที่สองยังมีความสามารถในการแบ่งเซลล์ต่ำซึ่งไม่เหมาะในการนำมาแยกโพรโทพลาสต์

         โพรโทพลาสต์ที่แยกออกมาได้แล้วหากนำมาเลี้ยงในสารละลายอาหารมาตรฐานที่ใช้ในงานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อทั่วไปทันที โพรโทพลาสต์มักแตกเพราะไม่มีผนังเซลล์มากั้นระหว่างเซลล์และสารละลายอาหาร ดังนั้นก่อนย้ายโพรโทพลาสต์ที่แยกออกมาไปเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยงควรควบคุมแรงดันออสโมติกภายในเซลล์ให้อยู่ในสภาพที่เหมาะสมเสียก่อน ซึ่งสังเกตได้จากรูปร่างของโพรโทพลาสต์ที่มีลักษณะกลม (ภาพที่ 1) โดยอาจใช้สารละลายกลูโคสหรือซูโครสร่วมกับน้ำตาลแอลกอฮอล์ (sugar alcohols) เช่น แมนนิทอลหรือซอร์บิทอล ซึ่งน้ำตาลกลูโคสและซูโครสจะช่วยให้การเจริญของโพรโทพลาสต์ในระยะแรกมีการสร้างผนังเซลล์ขึ้นใหม่ได้ดีขึ้น ส่วนน้ำตาลแอลกอฮอล์ที่ใส่ในอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์จะช่วยรักษาค่าออสโมติกของอาหารให้เท่ากับสารละลายภายในโพรโทพลาสต์ของพืชทำให้โพรโทพลาสต์ของพืชคงสภาพอยู่ได้

ภาพที่ 1 ก. โพรโทพลาสต์จากกลีบดอกชวนชม ข. โพรโทพลาสต์จากใบพิทูเนีย ที่อยู่ในสารละลายอาหารที่มีความเข้มข้นเท่ากับสารละลายภายในโพรโทพลาสต์

         เมื่อได้โพรโทพลาสต์ของพืชแล้ว นักวิจัยจะนำโพรโทพลาสต์ไปใช้ประโยชน์เพื่อการปรับปรุงพันธุ์พืช โดยการนำโพรโทพลาสต์ไปเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยง โดยจะเลือกโพรโทพลาสต์ของพืชต่างชนิดกันเพื่อปรับปรุงให้เป็นพันธุ์ลูกผสมตามที่ต้องการได้โดยให้มีการรวมกันของโพรโทพลาสต์ของพืช

 

การรวมโพรโทพลาสต์ (protoplast fusion) ของพืช

         โพรโทพลาสต์ที่อยู่ใกล้กันภายใต้สภาวะที่เหมาะสมอาจเกิดการรวมตัวกันของเยื่อหุ้มเซลล์และไซโทพลาซึมเกิดเป็นโพรโทพลาสต์ขนาดใหญ่ที่เรียกว่า ฟิวชันบอดี (fusion body) (ภาพที่ 2) ซึ่งอาจทำให้เซลล์มี 2 นิวเคลียสหรือมากกว่า ขึ้นอยู่กับเซลล์ที่มารวมกัน ในการรวมกันของโพรโทพลาสต์ระหว่างพืชชนิดเดียวกันเรียกว่า ฮอมอแคริออน (homokaryon) (ภาพที่ 3ก) ส่วนการรวมกันของโพรโทพลาสต์จากพืชต่างชนิดกันเรียกว่า เฮเทอโรแคริออน (heterokaryon) (ภาพที่ 3ข) โดยการรวมของโพรโทพลาสต์แบ่งได้เป็น 2 ชนิด คือ

         1. การรวมโพรโทพลาสต์ที่เกิดขึ้นได้เอง (spontaneous fusion) เช่น การปฏิสนธิของเซลล์สืบพันธุ์เพศผู้และเซลล์สืบพันธุ์เพศเมีย การรวมกันที่เกิดขึ้นจากการไหลไปมาของไซโทพลาซึมและออร์แกเนลล์ที่อยู่ติดกันในระหว่างการย่อยผนังเซลล์ซึ่งเป็นการรวมโพรโทพลาสต์ที่เกิดขึ้นเองมีโอกาสเกิดน้อยมากประมาณ 0.1 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ทั้งหมดที่ใช้เพาะเลี้ยง

         2. การรวมโพรโทพลาสต์ที่เกิดจากการชักนำ (induced fusion) วิธีชักนำให้โพรโทพลาสต์รวมกันมี 4 วิธี ดังนี้

               2.1 การใช้สารเคมี เช่น โพลีเอทิลีนไกลคอล (polyethylene glycon หรือ PEG)

               2.2 การใช้แคลเซียมไอออน (Ca²⁺) ในสภาพที่มีค่าความเป็นกรด-เบสสูง

               2.3 การใช้สารโพลีเอทิลีนไกลคอลร่วมกับแคลเซียมไอออนในสภาพที่มีค่าความเป็นกรด-เบสสูง

               2.4 การกระตุ้นด้วยกระแสไฟฟ้าซึ่งประกอบด้วย 2 ขั้นตอน โดยเริ่มต้นจากการใช้ไฟฟ้ากระแสสลับแรงดันต่ำกระตุ้นเข้าไปในสารละลายแขวนลอยโพรโทพลาสต์ จะทำให้เกิด      อิเล็กโทรโฟลิซิสส่งผลให้แต่ละโพรโทพลาสต์มาเรียงกันตามแนวสนามไฟฟ้าเป็นแถวคล้ายสร้อยไข่มุก จากนั้นเปลี่ยนใช้ไฟฟ้ากระแสตรงแรงดันสูงกระตุ้นเข้าไปในสารละลายแขวนลอย           โพรโทพลาสต์ จะทำให้เกิดการแตกของเยื่อหุ้มเซลล์แล้วตามมาด้วยการรวมกันของโพรโทพลาสต์

ภาพที่ 2 การรวมกันของโพรโทพลาสต์เกิดเป็นโพรโทพลาสต์ที่มีขนาดใหญ่ที่เรียกว่า ฟิวชันบอดี

และเป็นการรวมกันของโพรโทพลาสต์จากพืชต่างชนิดกันเรียกว่า เฮเทอโรแคริออน

 

ภาพที่ 3 แผนภาพการรวมกันของโพรโทพลาสต์ได้เป็นฮอมอแคริออนและเฮเทอโรแคริออน

         จากผลการศึกษาเรื่องการรวมโพรโทพลาสต์ของพืชต่างชนิด ทำให้ทราบว่าการรวมตัวของโพรโทพลาสต์นั้นเป็นปรากฏการณ์ทางกายภาพ และสามารถเกิดขึ้นระหว่างโพรโทพลาสต์ของพืชชนิดใด ๆ ก็ได้ หลังจากได้โพรโทพลาสต์ลูกผสมแล้วจึงนำไปเลี้ยงในอาหารเหลวหรืออาหารกึ่งแข็งกึ่งเหลวที่มีค่าออสโมติกเท่ากับสารละลายภายในโพรโทพลาสต์ของพืช จากนั้น            โพรโทพลาสต์จะสร้างผนังเซลล์ขึ้นได้ภายใน 24 ชั่วโมง ต่อมาจะเกิดเป็นเฮเทอโรแคริออน ซึ่งเป็นสภาพที่มีนิวเคลียสที่ต่างชนิดกันมาอยู่ด้วยกัน โดยเฮเทอโรแคริออนที่ได้จะยังไม่มีการรวมกันของนิวเคลียสในทันที การรวมตัวของนิวเคลียสอาจเกิดขึ้นได้หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 4-5 วัน ซึ่งผลจากการรวมกันของเฮเทอโรแคริออนสามารถเกิดลูกผสมได้ 2 แบบ คือ ไฮบริด (hybrid) และ ไซบริด (cybrid) โดยไฮบริดคือลูกผสมที่เกิดจากเฮเทอโรแคริออนที่มีการรวมกันของนิวเคลียส ไซโทพลาซึม และออร์แกเนลล์ภายในไซโทพลาซึมจากทั้งสองชนิด                ส่วนไซบริดคือลูกผสมที่เกิดจากเฮเทอโรแคริออนที่มีการรวมกันของไซโทพลาซึม และออร์แกเนลล์ภายในไซโทพลาซึมจากทั้งสองชนิด แต่ไม่มีการรวมกันของนิวเคลียสเกิดขึ้นซึ่งท้ายที่สุดจะมีนิวเคลียสจากชนิดใดชนิดหนึ่งเท่านั้น ซึ่งสามารถตรวจสอบคัดเลือกโพรโทพลาสต์ลูกผสมที่ต้องการโดย ตรวจจากลักษณะทางกายภาพของโพรโทพลาสต์ลูกผสมกับโพรโทพลาสต์พันธุ์พ่อแม่ หรือตรวจจากสัณฐานวิทยา หรือตรวจจากความสามารถในการผลิตสารเฉพาะซึ่งเป็น selectable marker ของโพรโทพลาสต์ลูกผสม เมื่อคัดเลือกลูกผสมได้แล้วจากนั้นนำไปเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมกับสภาพของโพรโทพลาสต์ของลูกผสมในขณะนั้น ซึ่งเป็นขั้นตอนการชักนำให้โพรโทพลาสต์สร้างผนังเซลล์ขึ้นมาใหม่ จากนั้นเซลล์ที่เกิดใหม่เกิดการแบ่งเซลล์กลายเป็นกลุ่มเซลล์เพาะเลี้ยง มีการเจริญและพัฒนาเกิดเป็นพืชต้นใหม่ต่อไป

ภาพที่ 4 แผนภาพการรวมกันของโพรโทพลาสต์พืชต่างชนิดได้เป็นไฮบริดหรือไซบริด

         ตัวอย่างของพืชที่ประสบความสำเร็จในการปรับปรุงพันธุ์โดยการใช้โพรโพลาสต์ของพืช คือ พืชวงศ์มะเขือ (Solanaceae) มีอยู่หลายสกุลด้วยกัน เช่น Nicotiana (ยาสูบ) Solanum(มะเขือ) Lycopersicon (มะเขือเทศ) Datura (แครอท) Petunia   (พิทูเนีย) และ พืชวงศ์ผักชี (Apiaceae) เนื่องจากพืชเหล่านี้มีขั้นตอนในการชักนำให้เกิดเป็นพืชต้นใหม่ได้ค่อนข้างง่าย            นักวิจัยจึงเริ่มใช้โพรโทพลาสต์ในการปรับปรุงพันธุ์พืชดังกล่าวก่อนเพื่อเป็นแนวทางในการปรับปรุงพันธุ์พืชเศรษฐกิจต่าง ๆ ต่อไป ส่วนพืชที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจอื่น ๆ เช่น พืชวงศ์ถั่ว การชักนำให้เป็นให้เกิดเป็นพืชต้นใหม่นั้นทำได้ยาก ซึ่งอาจเกิดจากอาหารที่ใช้เลี้ยงไม่เหมาะสมจึงชักนำให้เซลล์ที่ได้จากการแบ่งตัวของโพรโทพลาสต์ลูกผสมเกิดเป็นต้นพืชไม่ได้ ดังนั้นงานทางด้านโพรโทพลาสต์ของพืชส่วนใหญ่ยังเป็นคงเป็นงานวิจัยที่อาจนำไปใช้ร่วมกับวิธีการปรับปรุงพันธุ์ด้วยพันธุวิศวกรรม เพราะมีข้อจำกัดทั้งในเรื่องของค่าใช้จ่ายของราคาเอนไซม์ที่มีราคาสูง และโพรโทพลาสต์ที่ได้อาจต้องใช้เวลานานเพื่อที่จะหาสภาวะของการเลี้ยงและชักนำให้เป็นพืชต้นใหม่ และบางครั้งก็ไม่สามารถชักนำให้เป็นต้นได้เลยนั่นเอง

เอกสารอ้างอิงและเว็บไซต์สำหรับศึกษาเพิ่มเติม

1. คำนูณ กาญจนภูมิ. เทคโนโลยีโพรโทพลาสต์ของพืช. กรุงเทพฯ : สำนักพิมพ์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2545.

2. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. (Online) Available: PDF ไฟล์. (Retrieved 03/10/13)

3. บทที่ 9 โซมาติกไฮบริไดเซชันและไซบริไดเซชัน. (Online) Available: PDF ไฟล์. (Retrieved 03/10/13)

4. รายงานสืบค้นข้อมูลความก้าวหน้าและสถานะทางเทคโนโลยีชีวภาพของสิ่งมีชีวิตดัดแปลงทางพันธุกรรม (GMOs) ในประเทศสหรัฐอเมริกา. (Online) Available:http://www.ostc.thaiembdc.org/document/gmoreport_narin.pdf. (Retrieved 31/10/13)

5. นิตย์ศรี แสงเดือน.  พันธุศาสตร์พืช. พิมพ์ครั้งที่ 3. กรุงเทพฯ: สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, 2551.

6. การถ่ายฝากยีน (Gene transformation). (Online) Available:PDF ไฟล์. (Retrieved 14/03/14)

 

 36,102 total views,  11 views today